成牙本质细胞在牙髓免疫防御中的作用研究进展

成牙本质细胞在牙髓免疫防御中的作用研究进展

龋病是由细菌感染为主的牙体硬组织慢性进行性破坏性疾病，当牙釉质或牙骨质破坏后，细菌及其代谢产物经暴露的牙本质小管侵入，可触发牙髓牙本质复合体的免疫反应。成牙本质细胞位于牙髓外周且其胞突经牙本质小管伸向釉牙本质界或牙本质牙骨质界，是病原体入侵牙髓组织的第一道细胞防线。本文就成牙本质细胞的组织生理学特点及其在牙髓炎症免疫防御中的作用作一综述。

    1.成牙本质细胞的组织生理学特点

    成牙本质细胞起源于外胚间充质，胞体呈栅栏状排列于牙髓外围，胞突伸入牙本质小管且向外侧延伸到达釉牙本质界或牙本质牙骨质界。因龋损或磨耗破坏牙釉质或牙骨质导致牙本质暴露时，细菌及其代谢产物进入牙本质小管，成牙本质细胞作为牙髓组织的第一道防线，启动牙髓免疫和炎症反应。成牙本质细胞应对外界刺激时，可形成反应性牙本质或加速牙本质小管内的钙盐沉积、封闭牙本质小管，以延缓刺激传入牙髓。成牙本质细胞不仅可通过硬组织的形成减缓病原体入侵，还可识别病原体产生免疫球蛋白或抗菌因子，从而抑制病原体的生长和代谢。因牙髓和牙本质在胚胎发生上联系密切且对外界刺激的应答有互联效应，因此，牙髓和牙本质被认为是一个功能实体，称为牙髓牙本质复合体。由此可见，作为牙髓牙本质复合体的特征性细胞，成牙本质细胞的功能不仅局限于牙本质基质的沉积与矿化，在牙髓的免疫反应中也起重要作用；其免疫防御功能类似上皮屏障，可为牙髓提供天然屏障和保护牙髓组织抵御外界刺激的入侵。

    2.成牙本质细胞的炎症防御反应

    牙髓对致龋菌的免疫反应是由成牙本质细胞开始，炎症反应及其级联放大作用终将导致牙髓坏死甚至引发根尖周炎症。成牙本质细胞可通过分泌多种细胞因子引发并维持免疫反应。其中，趋化因子招募免疫细胞，促炎因子激发炎症反应，抑炎因子控制炎症反应。成牙本质细胞识别病原体并启动牙髓免疫反应主要集中于牙本质龋，Love等经菌群分析后认为，牙本质龋是以革兰氏阳性菌为主的混合细菌感染所致。脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）是革兰氏阳性菌细胞壁特有成分，且作为重要的表面特异性抗原引发宿主一系列免疫反应。Durand等以LTA刺激体外培养的成牙本质样细胞，培养上清中半胱氨酸-半胱氨酸趋化因子配体-2（cysteine-cysteine ligand，CCL-2）与半胱氨酸-X-半胱氨酸趋化因子配体-10（cysteine-X-cysteine ligand，CXCL-10）表达增加，使树突状细胞迁移显著性增加。

    Dommisch等以热灭活变形链球菌刺激成牙本质样细胞，而Carrouel等以纯化的金黄色葡萄菌LTA刺激同种细胞，白细胞介素6（interleukin，IL-6）和IL-8无论是mRNA还是培养上清中的蛋白水平均较对照组显著提高。一氧化氮（nitric oxide，NO）是左精氨酸在一氧化氮合成酶（nitric oxide synthases，NOS）的作用下生成胍氨酸过程中释放的一种毒性强、易扩散的自由基，在体内具有广泛的生物学特征，参与免疫、血管、神经、骨骼、消化等多个系统的生理功能调节和疾病的发生发展。Farges等研究表明，在正常牙髓组织中并未检测到NOS2，而在人成牙本质样细胞中，TLR2受体激动剂Pam2CSK4刺激可使NOS2表达增加，从而上调NO的表达，抑制变形链球菌的生长，维持牙髓微环境的稳态。

    综上所述，成牙本质细胞不仅可通过释放趋化因子和促炎因子激发牙髓炎症反应，同时还可通过分泌抑炎因子，抑制细菌的生长，从而抵御细菌入侵牙髓。上述研究大多利用体外构建人牙髓来源的成牙本质样细胞，通过细菌或产物诱导细胞产生细胞因子，无法解释成牙本质细胞在体内是如何参与牙髓免疫反应。Horst等提取龋齿牙髓组织并分离成牙本质细胞层（odontoblast layer，ODL）及下方固有牙髓，进行cDNA微阵列检测随后实时荧光定量PCR加以验证，对差异表达的细胞因子及受体进行统计分析，结果显示患龋ODL中有84个基因表达增加，其中35个基因与健康牙齿的ODL相比升高100倍以上。CCR2、CCR4、CCR5、CCR9、CCL3、CCL23在患龋ODL中表达显著提高，而在固有牙髓中并未发生明显改变。上述体内研究结果证实，成牙本质细胞确实参与牙髓免疫反应，且在细菌入侵牙本质小管时，产生趋化因子趋化免疫细胞并释放炎性介质，以达到清除危险刺激源及启动组织修复的目的。

    3.Toll样受体和NOD样受体在成牙本质细胞免疫防御中的作用

    细胞通过模式识别受体（pattern-recognition receptor，PPR）识别病原微生物表面的病原模式相关分子（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）启动固有免疫。由于成牙本质细胞所处位置特殊，使其成为牙髓组织中最早通过PPR识别PAMP的细胞。最早发现的胞外PPRToll样受体（Toll-like receptor，TLR）在牙髓固有免疫中扮演重要角色。在体外培养的成牙本质样细胞中可检测到TLR家族成员TLR1-6、TLR9的表达；LTA刺激后，TLR2、TLR3、TLR5和TLR9表达上调，使CCL2和CXCL10分泌增加，从而趋化未成熟的树突状细胞和白细胞。

    成牙本质细胞可能参与细菌及其产物的识别，例如三乙酰化脂蛋白（由TLR1和TLR2介导）、LTA（TLR2）、二乙酰化脂蛋白和肽聚糖（TLR2和TLR6）、LPS（TLR4）、细菌鞭毛蛋白（TLR5）和含非甲基化CpG二核苷酸的DNA（TLR9）以及病毒的双链RNA（TLR3）。其中TLR2和TLR4分别涉及革兰氏阳性和革兰氏阴性菌相关分子的识别，免疫组化证实TLR2与TLR4均在健康牙髓组织的ODL中表达，在龋病环境中或细菌及产物的刺激下，TLR2和TLR4的表达均上调。

    众多研究表明，TLR2受体激动剂Pam2CSK4或LTA刺激成牙本质样细胞后，可通过TLR激活宿主免疫反应，产生IL-6、IL-8、IL-10、CCL2等，引发牙髓炎症。Horst等研究显示，采用siRNA沉默TLR4可使热灭活细菌诱导的IL-8、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）释放显著减少；此外，还发现沉默TLR4后TLR2表达下降，表明TLR4与TLR2在成牙本质细胞中可能存在协同交互作用，共同调节牙髓免疫应答。这些研究结果均提示，TLR介导的炎症反应在成牙本质细胞免疫防御中扮演重要角色，但众多研究中尚未对TLR1、TLR3、TLR5、TLR6、TLR9进行深入机制研究，它们是否参与成牙本质细胞识别病原微生物以启动免疫反应，还有待进一步研究。除胞外模式识别受体TLR外，NOD样受体（nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR）也是近来牙髓免疫防御的研究热点，其中研究最多的是NOD1和NOD2蛋白。

    在牙髓组织中均可检测到NOD1和NOD2蛋白表达，NOD1在炎症牙髓中表达增加，而NOD2主要集中于ODL表达且在龋病环境中表达增加。Hosokawa等研究发现，在鼠成牙本质样细胞系KN-3中，NOD1配体（iE-DAP）可通过p38-AP-1信号通路激活下游的趋化因子，如CCL20、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）等表达，可能在牙髓炎的发生、发展中起重要作用。然而，由于该研究对象是鼠细胞系，以此来推断NOD1对人成牙本质细胞的作用存在一定的局限，其具体的机制还有待进一步研究。NLRP3是NLR家族中重要的成员，与多种分子共同构成高分子量蛋白复合体而形成炎性小体。

    Song等通过RT-PCR和Westernblot对牙髓组织中NLRP3表达进行检测，研究发现NLRP3在健康牙髓组织中表达，进一步通过免疫组化检测NLRP3蛋白在牙髓组织中定位情况，结果表明NLRP3主要分布与成牙本质细胞和牙髓血管内皮细胞，提示NLRP3介导的信号通路可能参与牙髓免疫防御。但NLRP3是如何参与牙髓免疫防御以及作用机制仍需进一步研究。TLR和NLR是两种重要的固有免疫受体，在病原入侵或组织损伤中能识别PAMP启动宿主免疫反应，二者之间在配体、信号通路、炎症分子等方面存在复杂的联系。在体外培养的成牙本质样细胞中，用TLR2配体（LTA或Pam2CSK4）均可上调NOD2mRNA的表达。采用TLR2配体（Pam2CSK4）、TLR4配体（LPS）、NOD1配体（iE-DAP）、NOD2配体（MDP）刺激牙髓成纤维细胞，IL-6和IL-8表达和蛋白分泌均增加，当联合运用MDP与Pam2CSK4、MDP与LPS，IL-6和IL-8表达水平均高于单独刺激，提示TLR与NOD2可能在牙髓炎发生发展中起协同作用，但具体相互作用机制仍未明确。

    4.自噬在成牙本质细胞免疫防御中的作用

    自噬是真核生物中一种高度保守的细胞内降解途径，是细胞应对外界刺激的一种保护机制，通过降解胞内受损的大分子蛋白或细胞器，以维持细胞内的稳态。炎症反应是机体应对病原体感染时的一种防御反应，通过一系列炎性介质的协同作用来清除刺激并促进组织修复；同时，炎性介质也可激活自噬，清除有害蛋白或聚集的细胞器，起到保护细胞的作用。近年较多研究表明，自噬通路及其相关蛋白在参与免疫应答中发挥重要作用。Pei和Wang等研究证实，自噬在牙本质细胞的炎症反应中起双重作用，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激6h内，自噬可维持细胞内稳态以提高细胞生存活力；但随着LPS刺激时间的增加，导致宿主细胞表面标志CD47的缺失，激活自噬从而诱导细胞凋亡。上述结果提示，自噬可能参与成牙本质细胞的免疫反应，但其如何调控免疫反应及相关机制还需进一步研究。

    5.展望

    深龋时细菌可经牙本质小管进入牙髓而引起牙髓感染。研究表明，牙本质厚度小于0.3mm时牙髓可有明显炎症。成牙本质细胞是牙髓的特征性细胞且位于牙髓外周，可能作为深龋或可复性牙髓炎的治疗靶点。Horst等发现，TGF-β1预处理可通过抑制TLR2和TLR4，下调由灭活菌感染的成牙本质样细胞IL-8和TNF-α的表达。此外，已有多项研究结果证实，在哺乳动物中行直接盖髓术时使用TGF-β1可加快牙髓组织的愈合以及修复性牙本质的形成。在LTA诱导的成牙本质细胞炎症反应模型中，脂多糖结合蛋白（LPS binding protein，LBP）可通过削弱TLR2与LTA结合后信号反应强度，降低炎性因子的表达水平，调节宿主免疫反应。

    Nakayama等提出，MPAID（MTI-Ⅱpeptide anti-inflammatory drug）可通过调控p65与DNA结合时间使炎症因子转录活性下降，可使KN-3细胞分泌IL-6、IL-8降低，从而保护损伤牙髓和调节牙髓免疫反应。越来越多研究证实，成牙本质细胞通过对外界刺激进行免疫监视，引发并维持牙髓炎症免疫反应。然而，成牙本质细胞对外界刺激的感知、其模式识别受体之间的相互作用机制尚未明确。前文中提到的成牙本质细胞因其所处位置及功能特殊，在牙髓组织中起到调控固有免疫和获得性免疫反应的作用，未来可能作为可复性牙髓炎的治疗靶点。然而，现今大部分关于成牙本质细胞研究大多局限于基础研究，具体如何研发生物制剂运用于临床，也是有待解决的问题。