重组人白细胞介素-1β诱导人牙髓细胞蛋白质组的差异分析

重组人白细胞介素-1β诱导人牙髓细胞蛋白质组的差异分析

【摘要】  目的 分析重组人白细胞介素-1β（rhIL-1β）诱导前后牙髓细胞蛋白质的差异，鉴定2组间差异表达的蛋白质。方法 采用双向凝胶电泳技术分离牙髓细胞全蛋白，获得对照组和诱导组牙髓细胞蛋白质图谱，Image Master 2D Elit 5.0软件分析确认差异表达蛋白。通过基质辅助的激光解吸飞行时间质谱对差异表达的蛋白质点进行质谱鉴定，得到肽质量指纹图谱。结果 比较对照组和诱导组蛋白质图谱，发现了39个蛋白质点差异明显。其中15个蛋白质点在诱导组高表达，新增13个蛋白质点，7个蛋白质点低表达，4个蛋白质点仅在对照组中表达；质谱鉴定后，10个蛋白得到确认。结论 牙髓细胞对rhIL-1β的应答反应是一个非常复杂的过程，多种蛋白质分子涉及其中。鉴定了牙髓细胞中与rhIL-1β作用密切相关的2个差异蛋白，为探索早期牙髓炎的应答机制提供了新的线索和思路。

【关键词】  重组人白细胞介素-1β； 双向电泳； 蛋白质组； 牙髓细胞； 肽质量指纹技术

 Differential proteomics analysis of dental pulp cell induced by recombinant human interleukin-1β

    GUO Shi-liang, ZHANG Ying-li, HUANG Yang.

    （Dept. of Endodontics, College of Stomatology, Jilin University, Changchun 130021, China; Dept. of Pediatric Dentistry, College of Stomatology, Jilin University, Changchun 130021, China）

    [Abstract]  Objective  To compare the proteomics change of human dental pulp cells induced by recombinant human interleukin-1β（rhIL-1β）. Methods  The dental pulp cell entire protein was separated by a two-dimensionalelectrophoresis（2-DE） technique. The rhIL-1β induction and the normal dental pulp cell protein 2-DE atlas were established. Difference expression protein was confirmed by ImageMaster 2D Elite 5.0 software analysis. To identify differentially expressed proteins spot by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, and get peptide mass fingerprinting. Results  Comparing the two groups of protein 2-DE atlas, 39 protein spots were obviously different. Including 15 points in the induction of protein expression were higher, 13 new protein spots, 7 protein points expressions were lower, there were only four points in the control group. After mass spectra identification, 10 protein spots were confirmed at last. Conclusion  Pulp cells to rhIL-1β responsiveness is a very complex process, which involve a variety of protein molecules. rhIL-1β related 10 protein spots have been identified in the dental pulp cell for the first time. To explore pulpitis′s early response mechanism provides a new clue and ideas.

    [Key words]  recombinant human interleukin-1β； two-dimensional electrophoresis； proteome； dental pulp cells；peptide mass fingerprint

    牙髓炎是口腔科常见病和多发病。其发病机制一直是人们关注的热点，目前研究多针对个别蛋白质展开，存在一定的局限性，无法从整体上探讨牙髓细胞的生物应答反应。蛋白质组学的出现弥补了上述研究的弊端，以整体观点来解析生命现象。本研究利用正常人牙髓细胞和重组人白细胞介素-1β（recombinant human interleukin-1β，rhIL-1β）诱导人牙髓细胞，通过蛋白质组学的方法，发现2组细胞间蛋白质表达的差异，并对差异蛋白质点进行分析和鉴定。

    1  材料和方法

    1.1  主要试剂和仪器
  
    rhIL-β（北京邦定生物公司），DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），固相pH梯度干胶条（IPGstrip）、固相pH梯度缓冲液（IPG buffer）、两性电解质（Pharmalyte）（Amersham公司，瑞典），超纯尿素、丙烯酰胺、甲双丙烯酰胺（Promega公司，美国），CHAPS+、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺、蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（phenylmethylsul-fonyl fluoride，PMSF）、过硫酸铵（ammonium per-sulfate，AP）、四甲基乙二胺（Sigma公司，美国），其余试剂为国产分析纯。低温高速离心机（Kubota公司，日本），紫外分光光度计（日本岛津公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞的培养  取第4代处于对数增殖期的人牙髓细胞（由吉林大学畜牧兽医学院重点实验室提供）用0.25%胰酶消化后，接种到100 cm2培养瓶中。实验分为2组，分别为对照组和诱导组，每组3份，共6瓶细胞。每瓶中细胞数达5×104个，在10%FBS的DMEM培养基中，37 ℃、5%条件下培养24 h。观察细胞生长情况，按时更换培养液，直到每瓶中细胞数达到5×107个。对照组更换无血清的DMEM培养液10 mL，诱导组更换无血清的DMEM培养液5 mL，然后加入200 ng·mL-1 rhIL-1β 5 mL，继续在37 ℃、5%条件下培养12 h。

    1.2.2  细胞总蛋白的制备  收集各组细胞，用4 ℃预冷的PBS洗涤3次，加入500 μL细胞裂解液，再分别加入10 μL终浓度为1 mmol·L-1 PMSF、1 mmol·L-1EDTA摇匀置于冰上裂解，最后加入10 μL终浓度为10 mmol·L-1 DTT。冰盒上4 ℃静置30 min，用细胞刮刮取并收集细胞裂解液，在冰浴条件下超声破碎5 min，工作2 s，间隔3 s，共60次，至溶液清亮。于4 ℃下40 000 g离心1 h，取少量上清液用Bradford法测定总蛋白质的浓度，其余上清液置-70 ℃冰箱内保存备用。

    1.2.3  固相pH梯度双向凝胶电泳  等电聚焦主要按G?觟rg等[1]的方法和IPGphorTM等电聚焦指南进行。取含125 μg细胞总蛋白液加入水化液至总体积250 μL，加入IPGphor水平电泳仪的胶条槽中。将IPG干胶条去保护膜胶面朝下，轻轻置入胶槽中，覆盖一层矿物油，盖好持胶槽盖，关上安全盖。水化和聚焦参数为：总电压时间为16 000 Vh，其中水化30 V，6 h；60 V，6 h。聚焦500 V，1 h；8 000 V，2 h。等电聚焦结束后，将每根IPG干胶条分别放入10 mL平衡液A（含1%DTT）和10 mL平衡液B（含2.5%碘乙酰胺）中，各平衡15 min。然后转入第二向电泳SDS-PAGE，凝胶浓度为12.5%，将平衡后的IPG胶条移至凝胶的上方，胶条一端放入低相对分子质量标准蛋白质Marker，0.5%的琼脂糖封闭[2]。上下槽加入电极缓冲液，电泳参数为：初始电流为每块胶10 mA，电泳15 min后，电流提高至每块胶20 mA，直至溴酚蓝前沿抵达胶边缘处为止[3]。

    1.2.4  银染方法  采用Amersham Biosciences公司《双向电泳实验手册》中推荐的硝酸银染色方法，同时结合相关文献[4]将其改进。

    1.2.5  凝胶图像分析 　凝胶通过ImageScanner扫描仪进行扫描获取图像，利用ImageMaster 2D Elite软件对图像进行强度校正、点检测、背景消减、匹配等分析，根据图像分析结果，获取有2倍差异的蛋白质点作为差异表达蛋白质。

    1.2.6  质谱鉴定  所用仪器为EtanTM MALDI-TOF质谱仪，加大总蛋白质上样量，选取表达有质或量差异的蛋白质点，标记后用过火灭菌的手术刀片沿凝胶边缘切下，置于1.5 mL Eppendorf管中，送交中国人民解放军军事医学科学院国家生物医学分析中心进行质谱分析。

    1.2.7  数据库查询  将质谱鉴定结果在互联网上相应数据库中（http://www.matrixscience.com）查询，以鉴定蛋白。

    2  结果

    2.1  对照组和诱导组牙髓细胞蛋白质组双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）图谱及其差异表达分析结果
  
    对照组和诱导组人牙髓细胞总蛋白质双向电泳图谱见图1。根据Cartesin坐标系统，横坐标从左到右等电点（pH）增加，纵坐标从下往上相对分子质量（×103）增加。各点染色深浅和面积差异很大，示意蛋白质量各不相同。大部分蛋白分布集中于等电点5～8，相对分子质量25×103～97×103的区域内，极酸性和极碱性蛋白很少。经软件进行匹配分析，结果显示，其中39个匹配的蛋白质点存在表达量上的差异，与对照组相比，诱导组蛋白质表达量上调的蛋白质点有28个，下调的有11个。其中15个蛋白质点在诱导组高表达，新增13个蛋白质点，7个蛋白质点低表达，4个蛋白质点仅在对照组中表达。质谱鉴定后，10个蛋白得到确认。

    2.2  差异蛋白质点的肽质量指纹图谱
  
    经过质谱鉴定、分析以及数据库的查询，鉴定了10个蛋白质点（表1）。
  
    上：对照组；下：诱导组；1～23、30～33、35为上调的蛋白质斑点；24～29、34、36～39为下调的蛋白质斑点。

    图 1  差异蛋白质点在2-DE