放射性涎腺损伤治疗的研究进展

放射性涎腺损伤治疗的研究进展

唾液具有消化、润滑、保护口腔微环境的稳定以及抗菌等多种作用，对维护口腔健康至关重要。全球每年约有55万罹患头颈部肿瘤患者，放射治疗是其治疗主要的方式。口干症是放疗术后主要的并发症之一，将导致唾液分泌的减少，从而引起龋齿、黏膜炎症、真菌感染及味觉丧失等多种疾病的产生，危害患者生活质量。
 
传统治疗方法主要有服用促涎腺剂、腺体转移、改进放疗技术及人工唾液及细胞保护剂等，但是上述治疗方法疗效有限，且存在药物副作用及有创操作等问题。因此寻找到合适的治疗涎腺功能损伤的方法，具有十分重要的意义。本文就目前有关放射性涎腺损伤治疗的研究进展作一综述。
 
1.放射性口干症的发生机制
 
涎腺主要是由能够分泌唾液腺泡细胞，围绕在腺泡细胞周围的肌上皮细胞和控制唾液分泌的导管细胞组成。放疗会对这些细胞及周围神经和血管同时造成损伤。将导致细胞空泡性变、组织纤维化及血管密度降低等，造成涎腺功能的受损。早期涎腺放射性损伤的主要原因是由于细胞膜上信号通路受干扰，导致毒蕈碱型胆碱受体（muscarinic receptor，M受体）以及水通道蛋白-5（aquaporin5，AQP5）功能障碍，引起早期唾液分泌急剧减少。晚期由于放疗后的延迟损伤效应导致涎腺组织内细胞微环境破坏，引发大量细胞凋亡，特别是涎腺特异性干/祖细胞数目的减少。由于损失的腺泡无法得到及时补充，同时伴随着不同程度的炎症和组织纤维化，最终导致涎腺功能障碍。
 
2.涎腺来源的干/祖细胞
 
Cotroneo等通过结扎涎腺导管的方式使腺体萎缩功能丧失，松开导管后，发现受损腺体功能逐渐恢复，唾液分泌量恢复至正常水平，且观察到部分导管细胞转化为腺泡细胞。由此推测，一些内源性涎腺细胞可能参与腺体组织的修复再生过程。Chibly等用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，BrdU）标记滞留细胞，发现一些具有增殖潜力并具有干/祖细胞特性的涎腺细胞，主要存在于涎腺的排泄管和闰管。证实涎腺组织内的确存在内源性涎腺干/祖细胞。研究者已经从鼠涎腺组织内成功分离出涎腺干/祖细胞，并且表达干细胞特异性表面标志物。如CD24，CD29，CD49f，CD117/ckit，clusterin和Sca-1。
 
Feng等也从人腮腺组织中分离具有自我更新能力的c-Kit阳性标记的细胞。Lombaert等利用小鼠下颌下腺（submandibular glands，SMG）细胞在体外进行唾液球培养，发现其中一些细胞特异性表达Sca-1，c-Kitand Musashi-1等干细胞表面标志物，并且这些细胞可以分化为能够分泌粘蛋白和淀粉酶的涎腺细胞，同时首次移植小鼠自体c-Kit+涎腺细胞，到小鼠放射性下颌下腺损伤的腺体内（每腺体约100～300个），证实可以长期恢复腺体功能，为涎腺干/祖细胞在放射性涎腺治疗中的应用，提供支持依据。
 
Nanduri等认为涎腺干/祖细胞与周围血管、基质和神经细胞组成的微环境，两者之间的相互联系对于腺体功能的长期稳定至关重要。而放疗会导致细胞微环境失衡，引发实质细胞凋亡，导致腺体功能受损。其通过实验发现不同类型的c-Kit+细胞亚群（CD24+，CD49f+，CD24+CD49f+）放疗损伤后，腺体功能恢复的能力有所差异，其中CD49f+对涎腺功能的恢复无明显影响，而c-Kit+CD24+CD49f+对腺体功能改善的效果最佳。并证实移植后的c-Kit+不仅可以在放射性损伤后的下颌下腺内长期存活，而且可分化为腺泡细胞和涎腺干/祖细胞，有助于恢复受损腺体组织内微环境稳态，进而有利于腺体功能的恢复。并进一步通过实验证明体外培养的CD24hi/CD29hi唾液球可以维持长期的细胞增殖及分化能力，且CD24hi/CD29hi拥有具有较高的干/祖细胞潜能。Pringle等则完整阐述了人SMG干细胞的分离、培养、增殖及分化能力的过程，并通过实验证实，经小鼠放射性损伤的下颌下腺腺体内注射少量人类c-Kit+细胞（每腺体至少500个），可使受损腺体能得到长期且巨大改善。
 
涎腺干/祖细胞对于放射性损伤涎腺的修复再生中起着至关重要的有作用，且凭借自体移植的优势，避免移植其他细胞可能发生的免疫反应。但临床中大多数接受放疗的患者均为老年患者，获取的细胞数目有限，其意味着需要更多的干/祖细胞来帮组组织修复。研究人员通过使用生长因子或醛脱氢酶-3在体外刺激c-Kit+细胞的增殖。Neumann等通过冷藏方式将分离出的涎腺干/祖细胞储存3年之久，仍保持原有的基因稳定性和功能的特异性。
 
3.非涎腺来源细胞及细胞提取物的治疗策略
 
大量的研究证明细胞治疗可改善受损器官功能，主要修复机制为：①移植后的细胞部分转化为相应部位的组织细胞或血管内皮细胞;②移植后的细胞通过释放多种分泌蛋白（如细胞因子、血管生成因子、激素及细胞外基质蛋白及酶等）和包含遗传物质的囊泡或外泌体（如double-stranded DNA、mRNA、microRNA及lncRNA）发挥旁分泌作用，从而起到抗细胞凋亡、促进细胞增殖和血管生成，并招募内源性干细胞向受损部位归巢等作用，帮组组织修复再生。现今，许多研究利用骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs）、人脂肪来源干细胞（Human adipose tissue-derived stem cells，hADSC）、人羊膜上皮细胞（Human amniotic epithelial cells，hAECs）等，进行放射性涎腺损伤治疗的研究。
 
目前，研究认为移植后的细胞主要通过旁分泌作用，对残存的涎腺干/祖细胞以及周围的微环境产生影响，起到保护及促进细胞增殖的作用。Lombaert等通过皮下注射FMS样酪氨酸激酶3配体、干细胞因子及G-CSF组合剂（称为F/S/G）到放射性涎腺损伤小鼠体内，4个月后检测发现腺体重量、唾液流量以及腺泡细胞数目明显增加，并发现大量的骨髓细胞回流至受损腺体内，但尚未观察到骨髓细胞转化为腺泡细胞。腺体功能恢复的主要原因可能为“归巢”后骨髓细胞分泌大量细胞因子，保护并刺激腺体内剩余干/祖细胞增殖分化。Lim等通过尾静脉向放射性下颌下腺损伤小鼠体内注射人脂肪间充质干细胞（human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，hAdMSCs），发现腺泡细胞凋亡明显减少，组织纤维化程度降低，并证实注射后的hAdMSCs可在腺体内存活至少4周，并有小部分转化为可以分泌淀粉酶的腺泡细胞。受损腺体功能恢复的主要原因为hAdMSCs所发挥的旁分泌作用。
 
An等通过低氧预处理hAdMSCs，测定其分泌蛋白包含多种细胞因子及生长因子（如GM-CSF、VEGF、IL-6和IGF1），含量对比常氧处理组明显增加。缺氧预处理有助于刺激hAdMSCs的旁分泌，释放更多有关组织修复和血管再生的细胞因子。并通过实验经尾静脉注射hAdMSCs入放射性下颌下腺损伤的小鼠体内，证实缺氧预处理后hAdMSCs分泌的分泌蛋白，可以更好地增强细胞抗凋亡能力且能够促进细胞增殖。Tran等将骨髓细胞裂解，提取其中可溶性物质，命名为“骨髓汤”（Bone marrow soup，BMsoup），通过实验比较，放射性下颌下腺损伤小鼠腺体原位注射和尾静脉注射BMsoup的治疗效果。证实两种治疗途径，起到大致相同的治疗效果，但原位注射的剂量是尾静脉注射剂量的1/4。同时测得参与组织修复再生的基因（MMP2，CyclinD1，BMP7，EGF和NGF）水平上调。
 
目前，关于各类生物活性成分如何有助于细胞旁分泌作用，其生物学机制仍在不断探究。目前经证实角质形成细胞生长因子可使接受放疗后小鼠腺体内干/祖细胞数目增加。WNT/β-catenin和SonicHedgehog（SHH）信号通路也起到相类似作用。应用EGF，IGF1，FGF2，IL6，ALDH3及EDA活化因子，可在不同程度上促进细胞增殖且抑制细胞凋亡。使用荷尔蒙褪黑激素可降低涎腺内氧化应激作用。有学者认为副交感神经对涎腺组织再生起重要作用。有研究表明，放射性涎腺损伤小鼠切除副交感神经后，其腺体功能无法正常恢复。Hai等证明改善副交感神经的支配能力，有助于放射性损伤涎腺功能的恢复。但各类细胞提取的生物活性成分中是否存在神经营养因子，或其中某些成分可直接保护副交感神经，以及可否通过腺体导管逆行注射或者腺体原位注射神经营养因子来改善受损腺体功能，是其机制目前尚需进一步研究。
 
胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）两者相类似，都具有多胚层分化的能力，理论上具有向涎腺细胞分化的潜能。Kawakami等将小鼠ESCs与人涎腺成纤维细胞共培养。1周后发现这些ESCs的形态结构发生明显变化;PCR检测发现淀粉酶及bFGF含量明显增加，将共培养后的ESCs注到正常的小鼠下颌下腺腺体内，1个月后检测发现移植处新生一些具有腺泡、导管和小叶等类似涎腺的组织结构，证实ESCs具有可转化为涎腺细胞的能力。HitomiOno等通过将胚胎SMG细胞及iPSCs共培养，在4d后发现iPSCs比胚胎SMG细胞形成更多类似腺泡样的结构以及更为发达的分支结构，认为iPSCs具有加速腺体分化和再生的能力。因此，通过进一步研究解决ESCs和iPSCs基因组稳定性及成瘤性等问题，二者有望成为治疗放射性涎腺损伤的新型种子细胞来源。
 
4.组织工程涎腺及类器官治疗策略
 
近年来，以细胞治疗为基础的人工涎腺（Artificial Salivary Gland）的构建为放射性涎腺损伤的治疗提供了新思路。人工涎腺是指在体外构建一个涎腺样类器官（Salivary Gland Organoids）然后植入体内发挥分泌功能，以达到治疗目的。Rookmaaker等认为类器官是一种来源于成体器官，可在体外培养，包含干/祖细胞，具有自我更新和组织特异性分化能力的器官样结构。类器官培养体系可最大限度的模拟细胞生长所需的各种环境和养分，使细胞能够在三维立体空间结构中迁移、生长，自我组装成具有三维特异性结构的类器官样组织。目前已有众多关于肺、大脑、胃、肝脏、肾脏、胰腺及前列腺等重要脏器类器官研究的报道，类器官能在结构和功能上模拟或者接近天然器官，其在人类器官发育研究、疾病机制研究尤其是癌症、药物筛选和器官再生修复等方面均有着重要的研究价值和应用前景。
 
涎腺组织工程构建涎腺类器官包括3个重要部分：细胞间的接触、细胞与胞外基质（extracellular matrix，ECM）的接触，以及具有良好生物学特性和细胞相容性的三维支架材料。目前支架材料主要有人工合成材料和天然ECM。人工合成材料主要采用人工合成多孔高分子材料如聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）以及两者之间的各种共聚物。Soscia等在聚二甲基硅氧烷（PDMS）中通过内衬静电纺聚乳酸-乙醇酸（PLGA）纳米纤维构建高度有序排列的弧形半球状“坑”，模拟体内唾液腺上皮细胞球形腺泡周围的基底膜三维结构。并发现改性的PLGA较Matrigel更能促进唾液腺细胞的分化。Chou等研究腮腺腺泡细胞（Parotid Gland Acinar Cells，PGACs）、成纤维细胞与5种生物材料［壳聚糖、聚乙烯醇（PVA）、聚乙烯-乙烯醇（EVAL）、聚偏氟二乙烯（PVDF）及组织培养聚苯乙烯（TCPS）］的相互作用关系，结果发现PVDF通过调节成纤维细胞释放NT4促进PGACs表达α-淀粉酶。
 
Baker等将Par-C10大鼠腮腺细胞系在Matrigel上培养一段时间可以得到类似腺泡样的具有分泌功能的球形结构。Ogawa等提取13.5～14.5d胚胎期的腺腺上皮组织和间充质组织，分离培养其中的上皮细胞和间充质细胞，将其与含胶原的凝胶一起培养，得到具体唾液分泌功能的涎腺类器官。但人工合成支架材料或者简单的复合几种细胞外基质蛋白在支架材料上很难达到模仿天然ECM结构和成分的效果，难以满足人工涎腺构建的各种生物学特性的需要。因此利用自体天然组织器官脱细胞的方法来构建生物支架逐渐成为一种替代方式。已有学者进行SMG全器官脱细胞后接种原代大鼠SMG细胞的研究。
 
利用脱细胞组织特异性细胞外基质来支持涎腺前体细胞增殖分化并形成功能性类器官，最大程度保持植入细胞之间，细胞与细胞外基质之间以及细胞与蛋白之间的联系，更符合细胞生物学的基本原则。因此，如何更有效的发挥组织特异性ECM促进涎腺细胞及其前体细胞的增殖与分化，并阐明相关调控机制，是涎腺组织工程和再生领域未来研究的一个重要方向。
 
5.小结
 
在过去的10年中，关于口干症的治疗取得了显著的成果，但是如何确定一种最理想的治疗方式，仍然面临着诸多挑战。首先要解决的是人成体干细胞在损伤动物模型的应用问题。人类和动物的腺体，存在生物学上的差异，对于放射性损伤的反应机制仍需进一步研究。其次，不同腺体之间的再生及修复能力存在差异（如腮腺、下颌下腺及舌下腺）。另外，由于照射的部位、剂量及患者年龄等自体特异性，将会造成的损伤程度各不相同和治疗方案的不同。随着类器官培养研究的不断深入，涎腺类器官的培养变得十分可行。未来可通过不同的干预措施，使涎腺类器官模拟涎腺放射性损伤的过程，进一步深入研究放射性涎腺损伤的机制。也可通过对个体细胞来源培养的涎腺组织类器官，进行不同药物治疗疗效或者药物毒性的相关评估，真正实现对每一位放射性涎腺损伤患者的精准且个性化治疗。
 
来源：王英鑫,王帅,张霓霓,黄桂林. 放射性涎腺损伤治疗的研究进展[J]. 临床口腔医学杂志,2017,33(11):696-699.